马铃薯源基因的可视化环介导等温扩增检测方法研究

张萌^1,2，古绍彬¹，于江晗¹，王德国²

（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471000；

2.许昌学院食品与药学院；河南省食品安全生物标识快检技术重点实验室，河南许昌461000）

摘要：为判断马铃著制品是否掺假，针对马铃薯内部转录间隔区（ITS），设计LAMP引物，建立一种马铃薯源DNA的可视化环介导等温扩增（LAMP）检测方法.结果表明，可视化LAMP检测方法最适温度是61℃，能将马铃薯DNA与与绿豆、大豆、红著、木薯、玉米和小麦DNA区分开，DNA检测灵敏度可达10pg·uL¹.该检测方法快速、高效、准确。

关键词：马铃薯；基因；环介导等温扩增；可视化；掺假；检测

中图分类号：Q81            文献标识码：A

淀粉作为人类食物的主要能量来源，广泛应用于食品加工业.但是对于原料掺假，如马铃薯淀粉中掺入玉米^[1]、木薯^[2]等行为，目前还没有相应的标准检测方法^[3].而感官评价^[4]、色谱法、光谱法^[5]等检测淀粉掺假法的应用范围有限.环介导等温扩增技术（LAMP）是一种新型核酸体外扩增技术，具有特异性强、灵敏度高、设备要求低、操作简单等优点^[6].而可视化LAMP技术是在LAMP技术基础上发展起来的，LAMP产物可通过肉眼鉴别、凝胶电泳、比色法等方法实现[].结合马铃薯内部的转录间隔区来设计LAMP引物，通过建立一种马铃薯源DNA的可视化LAMP检测方法来判断马铃薯制品是否掺假，以便为鉴别食品的真实性提供新思路.

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

材料：马铃薯、大豆、木薯、红薯、玉米、小麦等材料均为市售.

试剂：DP315型植物基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；SYBR Green I，北京索莱宝科技有限公司；TE缓冲液（pH=8.0），武汉生物科技有限公司；dNTP（10mmoL L¹），生工生物工程（上海）股份有限公司；Bst DNA聚合酶（10000U·mL¹），New England Biolab（北京）有限公司；Buffer 缓冲液（500mL），New England Biolab（北京）有限公司；DEPC水（500mL），上海翊圣生物科技有限公司.

仪器：DRAGON移液枪，北京大龙公司；NP-30S涡旋振荡器，常州恩培仪器制造有限公司；D10088掌上离心机，大兴龙创实验仪器（北京）有限公司；1-14K高速冷冻离心机，德国SIGMA公司；HH-2双孔水浴锅，北京诚驿恒仪科技有限公司；ABI Stepone plus实时荧光定量PCR，thermo fisher scientific log；NanoDrop One/OneCN微量核酸蛋白浓度测定仪，美国赛默菲世尔公司；DHG-907385干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；BCD-215KAJ冰箱、DW-86L386立式超低温冰箱，青岛海尔股份有限公司；LDZX-40SAI立式电动电热压力灭菌器，上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2F双人双面超净工作台，苏州净化设备有限公司；FA2004B电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司。

1.2试验方法

1.2.1引物设计与配制

根据GenBank数据库马铃薯源DNA，选取保守序列通过BLAST在线比对软件进行分析，选取保守性和特异性都较好的片段，利用Primer Explorer Version5在线设计软件设计一套LAMP引物，引物序列如表1所示.

1.2.2DNA提取及浓度测定

使用植物基因组DNA提取试剂盒提取马铃薯、红薯、大豆、小麦、玉米等材料的DNA，利用超微量核酸蛋白测定仪测定所提取DNA的浓度和纯度，置于-20℃冰箱中冷冻保存，备用.

1.2.3反应体系的配制

（1）实时荧光LAMP反应体系（100μL）.取10μLBufer，12μLdNTP，2.2μL引物，8μL镁离子，

0.5μL SYBR Green I，0.5uL Bst DNA聚合酶，11μL增强剂，45.8μLDEPC水.将混合液置于旋涡振荡器和掌上离心机上震荡混匀3次，备用；分装（9uL/管），每管再加1μL的DNA或者DEPC水，配制成10μL反应体系；滴加1滴液体石蜡进行密封，防止污染.

（2）可视化LAMP反应体系（100uL）.取10μL Buffer，12uL dNTP，2.2μL引物，5μL 10mmoL·L^-1锰离子，5μL指示剂，0.5 以L Bst DNA聚合酶，0.6μL增强剂，49.3以L DEPC水.将混合液置于旋涡振荡器和掌上离心机上震荡混匀3次，备用；分装（9μL/管），每管再加1μL的DNA或者DEPC水，配制成10μL反应体系；滴加1滴液体石蜡进行密封，防止污染.

1.2.4实时荧光LAMP检测

将1.2.3制备的10μL实时荧光LAMP反应体系置于实时荧光定量PCR仪器中，按照上面设计的操作过程设置反应程序，其中，反应循环120次，每个循环为30s，总反应时间为1h，通过观察扩增曲线进行实时荧光LAMP检测.

1.2.5可视化LAMP检测

将1.2.3制备的10μL可视化LAMP反应体系放入恒温水浴锅内，反应时间为1h.反应结束后在白色背景下观察颜色.如果是橘红色，说明DNA未扩增，为阴性结果；如果是黄色，则说明DNA扩增，为阳性结果^[12].

1.2.6LAMP反应温度优化

马铃薯DNA和DEPC水分别作为阳性样品和阴性对照，分别在57，59，61和63℃温度下进行实时荧光LAMP实验，确定最适反应温度。

1.2.7可视化LAMP特异性

加入马铃薯、红薯、大豆、小麦、玉米DNA和阴性对照DEPC水，在最适温度条件下进行可视化LAMP实验，检测方法的特异性.

1.2.8可视化LAMP灵敏度

加入不同浓度马铃薯DNA（马铃薯原液，100，10，1pg·μL^-1）和阴性对照DEPC水，在最适温度条件下进行可视化LAMP实验，检测方法的灵敏度.

2结果与讨论

2.1LAMP反应温度优化结果

马铃薯在不同温度条件下的实时荧光LAMP扩增曲线和熔解曲线分别如图1、图2所示.可以看出，当温度分别为57，59，61和63℃时，马铃薯DNA均出现扩增，阴性对照DECP水均未出现扩增.在温度为61℃时，马铃薯DNA扩增效率最快，因此LAMP反应的最适温度为61℃.

2.2可视化LAMP特异性结果

马铃薯的可视化LAMP特异性如图3所示.可以看出，当温度为61℃时，马铃薯DNA呈现明黄色，说明DNA扩增.阴性对照DEPC水和其他DNA（②绿豆，③大豆，④红薯，⑤木薯，⑥玉米，⑦小麦）均为橘红色，DNA未扩增.说明本次实验设计的马铃薯引物的特异性良好，能与绿豆、大豆、红薯、木薯、玉米、小麦进行区分。

2.3可视化LAMP灵敏度结果

马铃薯的可视化LAMP灵敏度如图4所示.可以看出，当温度为61℃时，阴性对照⑤、④和⑥的马铃薯DNA可视化LAMP呈橘红色，为阴性结果；而①、②、③的马铃薯DNA可视化LAMP呈现明黄色，说明DNA均出现扩增，为阳性结果.因此，在61℃条件下，可视化LAMP检测方法的灵敏度为10pg穟L1.

3结论

针对马铃薯内部转录间隔区（ITS），通过设计LAMP引物，建立一种马铃薯源DNA的可视化LAMP检测方法.结果表明，可视化LAMP检测方法的最适温度是61℃，此时引物特异性良好，可将马铃薯DNA与绿豆、大豆、红薯、木薯、玉米、小麦DNA区分开来，检测灵敏度可达10pg穟L1.该方法能够快速、高效、准确鉴定食品销售市场中的马铃薯成分.

参考文献：

[1]孙琛，石地娟，杨文英.木落淀粉中掺杂普通玉米淀粉的检测方法研究[J].粮食与饲料工业，2013（11）：28-29，34.

[2]王艳英，胥小荣，牛春玲，等.马铃薯淀粉中掺入木薯淀粉的鉴别检验[J].食品安全导刊，2020（29）：34-35.

[3]苏文，陈德经.淀粉鉴别方法研究进展[J].粮食与油脂，2016，29（1）：15-17.

[4]胡丽君.马铃薯淀粉质量检测技术研究[J].蔬菜，2015（4）：32-34.

[5]IUJ，LIJC，CHENJ，et al.Discri mination of Kudzu Starch Adulteration by Fourier Transform Infrared Spectroscopy

[J].Food Science，2011，8（32）：226-230.

[6]张曼，刘宝林，高志贤.环介导等温扩增技术的研究进展[J].食品安全质量检测学报，2019，10（18）：6124-6130.

[7]朱凯，康怀彬，王德国.可视化LAMP检测常见肉制品中猪肉成分[J].食品科学，2019，40（12）：296-302.

A Visual Loop-mediated Isothermal Amplification Method for Potato Gene Detection

ZHANG Meng^1,2，GU Shaobin¹，YU Jianghan¹，WANG Deguo²

（1.School of Food and Biological Engineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471000，China；2.Food and Pharmacy Colege；Key Laboratory of Biomarker Based Rapid-Detection Technology for Food Safety of Henan Province，Xuchang University，Xuchang 461000，China）

Abstract:In order to judge whether potato products are adulterated，LAMP primers were designed for the internal transcribed spacer（ITS）of potato，and a visual loop-mediated isothermal amplification（LAMP）method for detecting potato DNA was established.The results showed that the optimal temperature of the visual LAMP detection method was 61 ℃，which could distinguish potato DNA from mung bean，soybean，sweet potato，cassava，corn and wheat DNA，with a DNA detection sensitivity of 10 pg.uL^-1.The detection method was rapid，efficient and accurate.

Keywords:potato；gene；loop mediated isothermal amplification；visualization；adulterate；detection

责任编辑：卫世乾

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